熒光定量PCR（qPCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。熒光定量PCR可以采用兩種主要方法：熒光染料法（如SYBR Green I）和熒光探針?lè)ǎㄈ?/span>TaqMan探針），其中熒光探針?lè)芴峁└叩奶禺愋?。熒光定?/span>PCR實(shí)驗(yàn)中避免交叉污染是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的重要步驟。以下是一些關(guān)鍵措施：

分區(qū)管理與操作規(guī)范

1、?三區(qū)分離

l ?試劑準(zhǔn)備區(qū)?：僅配置PCR試劑，禁止核酸模板進(jìn)入。

l ?樣本處理區(qū)?：獨(dú)立完成核酸提取，避免試劑污染。

l ?擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)?：?jiǎn)蜗蛄鲃?dòng)設(shè)計(jì)，防止產(chǎn)物擴(kuò)散。

2、?耗材與消毒?

使用一次性耗材，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面每日用紫外線或DNA酶消毒，PCR儀反應(yīng)孔定期用含30%次氯酸鈉溶液清潔。

人員培訓(xùn)

專業(yè)培訓(xùn)：實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，熟悉PCR檢測(cè)的原理、方法和操作步驟，掌握樣品的提取、凈化和擴(kuò)增等技術(shù)要點(diǎn)，減少人為操作誤差和交叉污染的發(fā)生。

正確的實(shí)驗(yàn)操作

1、超凈工作臺(tái)：

實(shí)驗(yàn)應(yīng)在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，工作臺(tái)內(nèi)應(yīng)放置PCR專用的微量離心機(jī)、各量程的移液器和其他必需品。

2、更換手套：

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)選擇合適尺寸的手套并及時(shí)更換，進(jìn)出不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域或進(jìn)行模板操作后應(yīng)更換實(shí)驗(yàn)服、口罩、帽子及手套，以避免不同實(shí)驗(yàn)區(qū)交叉污染。

3、瞬時(shí)離心：

裝有PCR試劑的反應(yīng)管在打開之前應(yīng)先瞬時(shí)離心，將管壁及管蓋上的液體離至管底，降低污染手套或加樣器的風(fēng)險(xiǎn)。

污染源分析與監(jiān)測(cè)

1、?樣本間污染?

使用帶濾芯槍頭、避免反復(fù)吹吸混勻，樣本容器需嚴(yán)格密封。實(shí)驗(yàn)前可通過(guò)空氣對(duì)照（開蓋暴露1小時(shí)）監(jiān)測(cè)環(huán)境氣溶膠污染。

2、?試劑與設(shè)備污染?

每批次試劑設(shè)置陰性對(duì)照，定期用蒸餾水擦拭加樣槍、離心機(jī)等設(shè)備表面，通過(guò)擴(kuò)增檢測(cè)污染源。

嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生和清潔措施

1、定期清潔：使用消毒劑對(duì)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的表面、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、儀器和設(shè)備進(jìn)行chedi清潔和消毒。

2、70%乙醇擦拭：在實(shí)驗(yàn)前用70%乙醇擦拭工作臺(tái)，減少核酸酶和其他污染物。

專用工具和設(shè)備

1、專用工具：為每個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域提供專用的工具和設(shè)備，避免共用。

2、維護(hù)保養(yǎng)：定期維護(hù)和保養(yǎng)設(shè)備，防止因設(shè)備故障引發(fā)的污染。?

通過(guò)上述措施可系統(tǒng)性降低熒光定量PCR交叉污染風(fēng)險(xiǎn)，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。