摘要

神經(jīng)酰胺，尤其是?；窠?jīng)酰胺和蛋白結(jié)合神經(jīng)酰胺，對(duì)皮膚屏障的形成至關(guān)重要。然而，由于參與這些神經(jīng)酰胺生成的基因敲除會(huì)導(dǎo)致小鼠新生致死，其在成年小鼠中的敲除效應(yīng)一直不明確。

2025年5月，北海道大學(xué)藥學(xué)部生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的木原章雄研究團(tuán)隊(duì)在《Molecular Biology of the Cell》期刊上發(fā)表了題為“Relationship between time-dependent epidermal ceramide composition changes and skin barrier function in adult mice”的研究論文。該研究針對(duì)酰基神經(jīng)酰胺和蛋白結(jié)合神經(jīng)酰胺相關(guān)基因敲除導(dǎo)致新生小鼠致死，其在成年小鼠中的作用尚不明確的問(wèn)題，通過(guò)構(gòu)建他莫昔芬誘導(dǎo)的脂肪酸延長(zhǎng)酶Elovl1條件性敲除小鼠模型，探究了成年小鼠表皮中神經(jīng)酰胺組成的時(shí)間依賴(lài)性變化與皮膚屏障功能的關(guān)聯(lián)，同時(shí)揭示了皮膚屏障功能受損后的代償反應(yīng)機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)材料與儀器

材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：3月齡小鼠。

他莫昔芬、玉米油、dispase分散酶、蛋白K、甲苯胺藍(lán)O、染色試劑、氘標(biāo)記神經(jīng)酰胺標(biāo)準(zhǔn)品、氯仿、甲醇、乙酸、異丙醇、75%乙醇、RNAlater、TRIzol Reagent、DNA純化試劑盒、NucleoSpin RNA II Kit、PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、KOD FX DNA polymerase。

儀器

Veriti 96-Well Thermal cycler PCR儀、Amersham Imager 600凝膠成像儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、Illumina NovaSeq 6000測(cè)序儀、ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測(cè)量?jī)x、顯微鏡、組織破碎儀、離心機(jī)、Xevo TQ-XS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀。

ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測(cè)量?jī)x

實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1. 小鼠構(gòu)建與處理：通過(guò)Cre-ERT2小鼠系與Elovl1 flox小鼠系雜交獲得Elovl1 cKO小鼠和對(duì)照小鼠，均飼養(yǎng)在特定無(wú)病原體環(huán)境中（室溫23±1°C、濕度50±10%、12小時(shí)光照-黑暗周期），自由攝食飲水。對(duì)3月齡Elovl1 cKO小鼠進(jìn)行腹腔注射他莫昔芬，間隔1天，共5次，誘導(dǎo)Elovl1基因敲除。

2. 基因組PCR檢測(cè)：在他莫昔芬給藥后0、5、10、15、30天，采集小鼠背部剃毛皮膚，經(jīng)dispase 4°C孵育24小時(shí)分離表皮和真皮；取3.0mg干燥表皮，用裂解緩沖液和蛋白K處理后提取基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增Elovl1相關(guān)片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并定量，驗(yàn)證基因敲除效率。

3. 皮膚屏障功能檢測(cè)：

TEWL測(cè)量：在他莫昔芬給藥后0、5、10、15、20、25、30天，小鼠經(jīng)異氟醚麻醉、剃毛后，使用ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測(cè)量?jī)x在背部測(cè)量，每只小鼠測(cè)量2次取平均值。

甲苯胺藍(lán)染色：給藥30天后，頸椎脫臼處死小鼠，剃毛后經(jīng)甲醇處理、PBS洗滌，用0.1%甲苯胺藍(lán)O溶液4°C染色24小時(shí)；沖洗后將皮膚切成1cm2小塊，經(jīng)水孵育后測(cè)量630nm處吸光度，定量透皮的甲苯胺藍(lán)量。

4. 表皮形態(tài)觀察：在他莫昔芬給藥后0、10、30天，采集小鼠背部皮膚，制作切片并進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察表皮形態(tài)，測(cè)量基底層至顆粒層的厚度，記錄脂質(zhì)片層和角質(zhì)透明顆粒的變化。

5. 神經(jīng)酰胺組成檢測(cè)：在他莫昔芬給藥后0、5、10、15、30天，分離小鼠表皮，加入氯仿/甲醇混合液和鋯珠，經(jīng)組織破碎儀處理后提取脂質(zhì)；通過(guò)LC-MS/MS分析神經(jīng)酰胺的種類(lèi)和數(shù)量，利用氘標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量，計(jì)算脂肪酸鏈加權(quán)平均長(zhǎng)度。

6. 基因表達(dá)檢測(cè)：

RNA測(cè)序：給藥30天后采集小鼠背部皮膚，經(jīng)破碎、TRIzol提取總RNA并純化；構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)后在Illumina NovaSeq 6000上進(jìn)行150bp雙端測(cè)序，經(jīng)質(zhì)量控制、修剪和比對(duì)后，計(jì)算轉(zhuǎn)錄本每百萬(wàn)讀數(shù)值。

實(shí)時(shí)定量RT-PCR：將純化的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用特異性引物和KOD SYBR qPCR Mix，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上檢測(cè)目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)水平，以Hprt1為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

7. 統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Welch氏t檢驗(yàn)、Dunnett檢驗(yàn)和Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，p<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，通過(guò)SPSS進(jìn)行異常值檢驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

1. 酰基神經(jīng)酰胺和蛋白結(jié)合神經(jīng)酰胺對(duì)維持成年小鼠皮膚屏障功能至關(guān)重要，盡管其并非成年小鼠生存所必需；而相關(guān)基因敲除導(dǎo)致的這兩種神經(jīng)酰胺缺乏在新生小鼠中會(huì)引發(fā)致死性皮膚屏障缺陷。

2. Elovl1基因敲除后，成年小鼠表皮神經(jīng)酰胺呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性變化：?；窠?jīng)酰胺從第5天開(kāi)始下降，蛋白結(jié)合神經(jīng)酰胺從第10天開(kāi)始減少，總神經(jīng)酰胺從第15天開(kāi)始降低，NS神經(jīng)酰胺的減少最晚，而NP神經(jīng)酰胺從第15天開(kāi)始增加。

3. Elovl1基因敲除導(dǎo)致非?；坞x神經(jīng)酰胺的脂肪酸鏈縮短，且不同類(lèi)別神經(jīng)酰胺受影響的物種和變化時(shí)程存在差異；同時(shí)引發(fā)表皮形態(tài)改變，第10天即出現(xiàn)脂質(zhì)片層形成受損和表皮增厚，第15天出現(xiàn)部分脫毛和毛發(fā)褐變。

4. 皮膚屏障功能受損與神經(jīng)酰胺變化相關(guān)：第15天起TEWL明顯升高，且與?；窠?jīng)酰胺和蛋白結(jié)合神經(jīng)酰胺均降至對(duì)照組約30%的時(shí)間點(diǎn)一致；耳朵部位因皮脂腺數(shù)量少、皮脂分泌不足，皮膚屏障功能本身弱于背部和腹部。

5. 皮膚屏障功能降低后會(huì)啟動(dòng)代償反應(yīng)：包括Elovl3、Degs2等與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，NP神經(jīng)酰胺含量增加，以及角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化相關(guān)基因表達(dá)改變等。