設(shè)置多重PCR的陰性對照，?必須結(jié)合其高靈敏度、多靶標(biāo)共擴(kuò)增和易受污染干擾的特點(diǎn)，通過多類型陰性對照的組合使用，系統(tǒng)性監(jiān)控從樣本處理到擴(kuò)增全過程的污染風(fēng)險(xiǎn)，確保結(jié)果真實(shí)可靠?。由于多重PCR在單一反應(yīng)中同時(shí)檢測多個(gè)目標(biāo)，任何非特異性擴(kuò)增或交叉污染都可能導(dǎo)致假陽性誤判，因此陰性對照的設(shè)計(jì)需更加嚴(yán)謹(jǐn)。

一、多重PCR中陰性對照的核心類型與設(shè)置要點(diǎn)

無模板對照（No Template Control, NTC）?

操作方式?：用無菌水或緩沖液替代模板DNA/RNA，其余反應(yīng)組分與實(shí)驗(yàn)組一致。

作用?：檢測PCR試劑、耗材或操作環(huán)境中是否存在外源DNA污染或擴(kuò)增產(chǎn)物殘留。

多重PCR特別關(guān)注點(diǎn)?：

多重體系中引物濃度較高，易形成引物二聚體，NTC可同時(shí)用于評(píng)估非特異性擴(kuò)增風(fēng)險(xiǎn)；

若使用熒光探針法，需確認(rèn)所有通道均無擴(kuò)增信號(hào)，避免串?dāng)_誤判。

無逆轉(zhuǎn)錄酶對照（–RT Control）?

適用場景?：以RNA為起始模板的多重RT-PCR實(shí)驗(yàn)。

操作方式?：在逆轉(zhuǎn)錄步驟中省略逆轉(zhuǎn)錄酶，其余條件相同。

作用?：驗(yàn)證RNA樣本中是否殘留基因組DNA（gDNA），防止其被誤擴(kuò)增產(chǎn)生假陽性信號(hào)。

判斷標(biāo)準(zhǔn)?：若–RT對照出現(xiàn)擴(kuò)增，提示gDNA污染，需對RNA樣本進(jìn)行DNase處理。

陰性樣本對照（Negative Sample Control）?

操作方式?：使用已知不含目標(biāo)序列的樣本（如健康人基因組DNA、無菌水或陰性基質(zhì)）進(jìn)行全流程檢測。

作用?：監(jiān)控從核酸提取到擴(kuò)增全過程中的交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。

建議?：與待測樣本同步處理，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)可比性和質(zhì)控效力。

空白提取對照（Extraction Blank Control）?

操作方式?：在核酸提取階段使用無菌水代替樣本，經(jīng)歷相同的提取流程。

作用?：檢測提取試劑或耗材是否被污染，屬于“過程陰性對照”。

二、結(jié)合多重PCR特點(diǎn)的優(yōu)化策略

每批次至少設(shè)置一個(gè)NTC?，高通量檢測時(shí)建議增加重復(fù)數(shù)以提高監(jiān)控可靠性；

合理安排加樣位置?：將陰性對照置于反應(yīng)板邊緣孔或獨(dú)立區(qū)域，避免因加樣誤差影響其他樣本；

多重信號(hào)區(qū)分?：在熒光定量多重PCR中，確保陰性對照在所有檢測通道均無擴(kuò)增曲線，排除探針串?dāng)_或非特異結(jié)合；

污染溯源機(jī)制?：一旦陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果，應(yīng)立即排查試劑、移液器、操作臺(tái)面等潛在污染源，并重新運(yùn)行實(shí)驗(yàn)；

使用防污染技術(shù)?：

采用含dUTP/UNG酶的防污染體系，降解可能殘留的PCR產(chǎn)物；

使用一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（如含NC Buffer的試劑盒），便于設(shè)置–RT對照并減少操作引入污染的風(fēng)險(xiǎn)。