人γ干擾素(IFN-γ)ELISA檢測試劑盒實驗使用說明書

　　BS-0033人γ干擾素(IFN-γ)ELISA試劑盒

　　一、實驗原理

　　本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測人γ干擾素(IFN-γ)水平。實驗步驟如下：

　　包被抗體?：將抗人IFN-γ單克隆抗體預(yù)包被于微孔板，形成固相抗體。

　　抗原結(jié)合?：加入樣本或標(biāo)準(zhǔn)品，IFN-γ與固相抗體結(jié)合。

　　酶標(biāo)抗體反應(yīng)?：加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體，形成“抗體-抗原-酶標(biāo)抗體”復(fù)合物。

　　顯色與檢測?：加入底物TMB顯色，HRP催化TMB轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，酸終止后變黃色。顏色深淺與IFN-γ濃度正相關(guān)，用酶標(biāo)儀在450nm波長測定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本濃度。

　　二、試劑盒組成

　　預(yù)包被微孔板?：12孔×8條(96孔配置)或12孔×4條(48孔配置)，2-8℃保存。

　　標(biāo)準(zhǔn)品?：凍干粉，復(fù)溶后配制梯度濃度(如1000→500→250→…→15.625 pg/mL)，2-8℃保存。

　　酶標(biāo)試劑?：HRP標(biāo)記的檢測抗體，2-8℃避光保存。

　　顯色底物?：TMB溶液，避光保存。

　　終止液?：2M溶液，操作時需戴手套。

　　其他?：封板膜、洗滌液(20×濃縮液)、樣本稀釋液、說明書。

　　三、樣本收集與處理

　　樣本類型?：

　　血清?：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心(2000-3000轉(zhuǎn)/分，20分鐘)，收集上清。

　　血漿?：EDTA或肝素抗凝，離心后取上清。

　　細(xì)胞培養(yǎng)上清?：離心去除顆粒物，避免反復(fù)凍融。

　　其他體液?(如腦脊液、胸腹水)：澄清后檢測。

　　保存?：短期(≤7天)2-8℃保存，長期需分裝凍存于-80℃，避免反復(fù)凍融。

　　四、實驗步驟

　　試劑準(zhǔn)備?：

　　洗滌液：將20×濃縮液用蒸餾水稀釋為1×工作液。

　　標(biāo)準(zhǔn)品：凍干粉加1mL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液復(fù)溶，梯度稀釋(如1000→500→…→15.625 pg/mL)。

　　加樣?：

　　標(biāo)準(zhǔn)品孔：各加50μL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品。

　　樣本孔：加10μL樣本+40μL樣本稀釋液(血清/血漿建議1:5稀釋，細(xì)胞上清1:2稀釋)。

　　溫育?：37℃避光孵育30分鐘。

　　洗滌?：甩干孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置1分鐘后甩干，重復(fù)5次，拍干。

　　酶標(biāo)抗體?：每孔加50μL酶標(biāo)試劑，37℃孵育30分鐘。

　　顯色?：每孔加50μL顯色底物，37℃避光孵育15分鐘。

　　終止?：每孔加50μL終止液，混勻后立即測定OD值(450nm)。

　　五、結(jié)果計算

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線?：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X)，OD值為縱坐標(biāo)(Y)，擬合直線回歸方程。

　　樣本濃度?：將樣本OD值代入方程，乘以稀釋倍數(shù)，得到實際濃度(pg/mL)。

　　六、注意事項

　　試劑保存?：未使用板條密封保存于2-8℃，避免受潮;TMB避光。

　　樣本處理?：避免溶血、高血脂樣本;高濃度樣本需預(yù)實驗確定稀釋倍數(shù)。

　　操作規(guī)范?：

　　加樣避免氣泡，槍頭一次性使用。

　　溫育時間嚴(yán)格控制在規(guī)定范圍內(nèi)，防止蒸發(fā)。

　　洗滌，拍干時避免吸水紙直接接觸孔內(nèi)。

　　質(zhì)量控制?：每批次設(shè)空白孔(S0)及陰性對照。

　　安全提示?：終止液含酸，需戴手套操作;廢棄物按生物危害處理。

　　七、性能參數(shù)

　　靈敏度?：≤1.0 pg/mL。

　　檢測范圍?：15.63–1000 pg/mL。

　　精密度?：板內(nèi)/板間變異系數(shù)<10%。

　　回收率?：83%-113%。

　　特異性?：不與IL-2、IL-4等細(xì)胞因子交叉反應(yīng)。

　　八、有效期

　　試劑盒在2-8℃下有效期為6個月，拆封后標(biāo)準(zhǔn)品建議分裝凍存于-20℃。

　　注：以上僅供參考，本產(chǎn)品僅供科研使用，不作為實際數(shù)據(jù)，實驗需嚴(yán)格遵循說明或咨詢技術(shù)老師。

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